Phase 1: 细胞培养与准备工作（第1-3天）
材料与试剂：
- 人RA成纤维样滑膜细胞（FLS），来自商业来源（Celprogen, Cat#: 3605-05或相当产品）
- 完全培养基：DMEM/F-12 (Gibco, Cat#: 11320033) + 10% FBS (Gibco, Cat#: 16000044) + 1% 青霉素/链霉素 (Gibco, Cat#: 15140122)
- 无酚红培养基（用于刺激实验）：DMEM/F-12无酚红 (Gibco, Cat#: 11039021)
- 0.25% 胰蛋白酶-EDTA (Gibco, Cat#: 25200056)
- PBS, pH 7.4 (Gibco, Cat#: 10010023)
- 细胞计数板 (Neubauer improved)
- T75培养瓶 (Corning, Cat#: 430641U)
- 6孔培养板 (Corning, Cat#: 3516)
- 96孔培养板 (Corning, Cat#: 3599)
操作步骤：
从液氮中取出RA FLS细胞，快速放入37°C水浴解冻
转移细胞至T75培养瓶，加入10 mL预热完全培养基
37°C、5% CO2条件下培养24小时
弃旧培养基，PBS清洗2次，加入新鲜完全培养基
每日观察细胞汇合度，细胞达80-90%汇合度时进行传代
传代：弃培养基，PBS清洗，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化3-5分钟
中和胰蛋白酶，离心（300×g, 5分钟），重悬于完全培养基
细胞计数，调整浓度至1×10^5 cells/mLPhase 2: carH3和carH3-免疫复合物刺激实验（第4-5天）
材料与试剂：
- carH3蛋白（重组人源化单克隆抗体，浓度：1 mg/mL in PBS）
- carH3-免疫复合物（carH3与抗原以1:5摩尔比配制，室温孵育30分钟）
- 抗原蛋白（人IgG或特定靶抗原，10 μg/mL）
- Vehicle对照：PBS
- Isotype对照抗体：Human IgG1同型对照（BioLegend, Cat#: 403502），浓度匹配carH3
- IFN-γ阳性对照：100 ng/mL (PeproTech, Cat#: 300-02)
- TNF-α阳性对照：10 ng/mL (PeproTech, Cat#: 300-01A)
实验设计（6组，每组3个生物学重复）：| 组别 | 处理 | 浓度 |
|------|------|------|
| 1 | Vehicle对照 | PBS |
| 2 | Isotype对照 | 10 μg/mL |
| 3 | carH3单体 | 10 μg/mL |
| 4 | carH3-免疫复合物（低浓度） | 1 μg/mL carH3 |
| 5 | carH3-免疫复合物（高浓度） | 10 μg/mL carH3 |
| 6 | 阳性对照（TNF-α + IFN-γ） | 10 ng/mL + 100 ng/mL |
操作步骤：
将RA FLS细胞以1×10^5 cells/mL密度接种于6孔板，每孔2 mL
37°C、5% CO2培养24小时，使细胞贴壁并达到70-80%汇合
弃旧培养基，每孔加入1.8 mL无酚红DMEM/F-12（含有0.5% FBS）进行血清饥饿
血清饥饿4小时后，弃培养基
按实验设计添加不同处理：
- 每孔加入2 mL含相应处理的新鲜培养基
- 每个处理做3个生物学重复
6. 37°C、5% CO2培养，分别在6小时和24小时时间点收集样本
收集条件培养基（用于细胞因子检测），保存于-80°C
用PBS清洗细胞2次，用于RNA提取Phase 3: RNA提取与质量控制（第6天）
材料与试剂：
- TRIzol Reagent (Ambion, Cat#: 15596026)
- 氯仿（分析纯）
- 异丙醇（分析纯）
- 75%乙醇（DEPC处理水配制）
- DEPC处理水 (Ambion, Cat#: 4387937)
- NanoDrop One分光光度计 (Thermo Fisher)
- Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies)
- RNA 6000 Nano Kit (Agilent, Cat#: 5067-1511)
- Qubit 3.0 Fluorometer (Thermo Fisher)
- Qubit RNA HS Assay Kit (Thermo Fisher, Cat#: Q32852)
操作步骤：总RNA提取：
每孔加入1 mL TRIzol，轻轻吹打裂解细胞
室温孵育5分钟，转移至1.5 mL EP管
加入200 μL氯仿，剧烈震荡15秒
室温孵育2-3分钟
4°C, 12,000×g离心15分钟
转移上层水相至新EP管（约500 μL）
加入500 μL异丙醇，颠倒混匀
室温孵育10分钟
4°C, 12,000×g离心10分钟
弃上清，加入1 mL 75%乙醇清洗
4°C, 7,500×g离心5分钟
弃乙醇，空气中干燥5-10分钟
加入30-50 μL DEPC处理水溶解RNA
56°C孵育10分钟促进溶解RNA质量评估：
NanoDrop检测：A260/280 ratio ≥ 1.8，A260/230 ratio ≥ 1.5
Qubit定量：确保RNA浓度 ≥ 100 ng/μL
Agilent Bioanalyzer分析：
- RIN值 ≥ 8.0
- 28S/18S比值 ≥ 1.5
- 无明显DNA污染峰
Phase 4: 转录组测序与生物信息学分析（第7-14天）
材料与试剂：
- NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit (NEB, Cat#: E7760S)
- NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module (NEB, Cat#: E7490S)
- NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (NEB, Cat#: E7500S)
- AMPure XP beads (Beckman Coulter, Cat#: A63880)
- Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent, Cat#: 5067-4626)
- Illumina HiSeq 4000或NovaSeq 6000测序平台
操作步骤：mRNA富集：
使用Poly(A)磁珠富集mRNA
加入2×上样缓冲液，混合后65°C变性5分钟
室温混匀2分钟进行mRNA结合
使用磁力架分离，洗涤2次
加入Tris缓冲液重悬，94°C变性
室温复性，磁力分离，收集mRNA文库构建：
进行mRNA片段化（94°C, 15分钟）
第一链cDNA合成（逆转录酶，25°C 10分钟，42°C 50分钟，70°C 15分钟）
第二链cDNA合成（DNA polymerase I, RNase H）
末端修复和A碱基加尾
接头连接
PCR扩增（15个循环）
AMPure XP beads纯化，250-300 bp片段选择测序与数据分析：
文库质量验证（Bioanalyzer DNA 1000）
定量（qPCR）
混合文库，Illumina平台测序（150 bp双端，30-50 M reads/样本）
原始数据质控（FastQC）
序列比对（STAR或HISAT2至GRCh38参考基因组）
基因表达定量（RSEM或featureCounts）
差异表达分析（DESeq2或edgeR）：
- 阈值设定：|log2FC| ≥ 1, padj ≤ 0.05
8. GO富集分析（DAVID或Metascape）
KEGG通路分析
GSEA分析Phase 5: 细胞因子分泌检测（第6天，与RNA收集同步）
材料与试剂：
- LegendPlex Human Inflammation Panel 1 (BioLegend, Cat#: 740808)
- LegendPlex Human Cytokine Panel 2 (BioLegend, Cat#: 740809)
- 或者Luminex Performance Human Cytokine Base Kit A (R&D Systems, Cat#: LKTM015A)
- IL-6 ELISA Kit (BioLegend, Cat#: 430504)
- TNF-α ELISA Kit (BioLegend, Cat#: 430204)
- IL-8 ELISA Kit (BioLegend, Cat#: 431504)
- MMP-3 ELISA Kit (R&D Systems, Cat#: DY516)
- 标准品、捕获 beads、检测抗体、PE-链霉亲和素
- 96孔V底板（Corning, Cat#: 3897）
- Magpix流式荧光检测仪（Luminex）或酶标仪
检测细胞因子（14种）：IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, MCP-1, MIP-1α, IL-10, IL-12p70, IL-17A, IL-23, MMP-3
操作步骤：
Multiplex检测（LegendPlex）：
取出冻存条件培养基，4°C解冻
96孔V底板加入25 μL捕获beads
加入25 μL标准品或样品
4°C振荡孵育过夜（16-18小时）
洗涤：每孔加入200 μL洗涤缓冲液，1000×g离心5分钟，弃上清
加入25 μL检测抗体混合物
室温振荡孵育1小时
加入25 μL PE-链霉亲和素
室温振荡孵育30分钟
洗涤2次
每孔加入150 μL读数缓冲液
Magpix仪器读取ELISA验证：
96孔板包被捕获抗体，4°C过夜
洗涤，阻断液封闭1小时
加入样品或标准品，37°C孵育2小时
洗涤，加入检测抗体，37°C孵育1小时
洗涤，加入TMB底物，室温避光显色
加入终止液，450 nm读数Phase 6: qPCR验证差异表达基因（第15-17天）
材料与试剂：
- PrimeScript RT Reagent Kit (Takara, Cat#: RR037A)
- TB Green Premix Ex Taq II (Takara, Cat#: RR820A)
- 实时荧光定量PCR仪（Applied Biosystems 7500 Fast）
- 96孔PCR板 (Applied Biosystems, Cat#: 4346906)
- 基因特异性引物（见下表）
验证基因引物序列：| 基因 | Forward Primer (5'-3') | Reverse Primer (5'-3') |
|------|------------------------|------------------------|
| IL6 | CTGCAGCCACTGGTTCTGT | CCAGAGCTGTGCAGATGAGTA |
| CXCL8 (IL8) | AAGAGAGCTGTGTCCTTGGGT | GGGGTGGAAAGGTTTGGAGT |
| TNF | AGGACGAACATCCAACCTTC | GTTGACCTTGGTCTGGTAGGA |
| CCL2 (MCP1) | AGCAACTGTGACCGCGAGCTTC | CGAGCAGACTGCCCACTCAACC |
| MMP3 | AGGCATCGAGAGTGGTCATG | CACTTGGCTGAGTGGTAGAGT |
| CXCL10 | CCATTCTGATTTGCTGCCTTAT | GGTACAGTGGGCTCATTCCA |
| CCL20 | TACTCCACCTCTGACACCTC | GACACCTTCATCAAAAGCCTG |
| CXCL1 | AGCTTGCCTCAATCCTGCAT | GTGCATTCCGCTCGAGGTTT |
| IL1B | CCAGCTACGAATCTCCGACC | TCTTTCAACACGCAGGACAG |
| MMP13 | CCAGCTGTCCTTGGCACTC | GCATCTGGAGTCCTTGAAGGT |
操作步骤：
使用Takara PrimeScript RT Kit进行逆转录：
- 20 μL体系：4 μL 5×PrimeScript Buffer, 1 μL PrimeScript RT Enzyme, 1 μL Oligo dT, 1 μL Random 6 mers, 10 μL RNA (1 μg)
- 条件：37°C 15分钟，85°C 5秒
2. qPCR反应（20 μL体系）：
- 10 μL TB Green Premix Ex Taq II
- 0.8 μL Forward Primer (10 μM)
- 0.8 μL Reverse Primer (10 μM)
- 2 μL cDNA (1:5稀释)
- 6.4 μL RNase Free Water
3. qPCR程序：
- 95°C 30秒（预变性）
- 40个循环：95°C 5秒，60°C 30秒
- 熔解曲线：95°C 15秒，60°C 1分钟，95°C 15秒
4. 数据分析：ΔΔCt方法，以GAPDH或β-actin为内参基因
计算相对表达量：2^(-ΔΔCt)